《PNAS》：UCI与哈佛构建EBV人扁桃体类器官，解析原发感染 B、T 细胞应答

Epstein-Barr病毒（EBV）是一种嗜B细胞的γ疱疹病毒，全球超过95%的成人呈慢性感染状态。该病毒与传染性单核细胞增多症（IM）、多种B细胞淋巴瘤、鼻咽癌以及部分自身免疫病（如多发性硬化、系统性红斑狼疮）的发生发展存在关联。Waldeyer环（包括扁桃体）是EBV原发感染的主要解剖部位，B细胞是其持续感染的主要靶细胞。然而，由于大多数原发感染呈隐匿性或无症状性，且缺乏能够较好模拟人类二级淋巴组织微环境的体外模型，EBV在生理组织环境中如何重塑B细胞命运、诱导其进入生发中心（GC）反应或滤泡外分化，并在此过程中与T细胞互作，长期以来尚不清楚。

长期以来，阻碍EBV原发感染早期事件解析的关键研究空白（Research gap）在于缺乏适用且保真的体外研究模型。传统的二维（2D）B细胞培养或外周血单个核细胞（PBMC）感染模型难以重现淋巴组织的滤泡结构、细胞组成及空间微环境；普通小鼠不被EBV感染；人源化小鼠可用于研究EBV相关基础生物学，但其淋巴组织结构以及GC和记忆B细胞发育仍存在局限。因此，建立一套能够保留人类扁桃体免疫微环境、支持EBV感染并允许同步评估B细胞与T细胞动态互作的三维模型，具有较为重要的转化医学价值。

基于上述背景，本研究的核心科学问题（Research questions）主要聚焦于以下几个维度：第一，能否从人扁桃体组织中建立可扩展的类器官（organoids）模型，并成功建立EBV原发感染体系？第二，EBV感染B细胞在生理淋巴微环境中是否获得生发中心样表型，其转录组、B细胞受体（BCR）谱系及克隆演化特征如何？第三，在该体外类器官平台中，CD4与CD8 T细胞分别对EBV+ B细胞扩增具有何种调控作用？

为了解答这些关键科学问题，美国加州大学尔湾分校（UCI）的Lisa E. Wagar、哈佛大学Brigham and Women's Hospital的Benjamin E. Gewurz等研究团队展开了系统性研究。研究团队从40名扁桃体切除术后供者获得类器官培养物，涵盖不同年龄、性别及EBV血清学状态；其中部分模型进行了长达21天的纵向单细胞多组学分析。并对感染动力学、B细胞表型与转录异质性、BCR谱系演化、T细胞应答特征及CD4/CD8 T细胞去除实验进行了评估。

01 研究亮点

（1）从40名供者中成功建立了人扁桃体类器官体系，并使用GFP标记的Akata EBV毒株建立了可追踪的感染模型，观察到EBV+ B细胞在感染后第14天出现显著扩增。

（2）EBV+ B细胞多获得生发中心（GC）样或pre-GC表型，且大多数位于典型GC之外；多数GC样EBV+ B细胞低表达BCL6，并富集亮区标志物CD83。

（3）BCR谱系分析提示EBV感染可能促进类别转换（CSR），但多数克隆未伴随显著的体细胞高频突变（SHM），仅少数谱系（约0.84%）表现出较复杂的GC样克隆演化。

（4）去除CD4 T细胞后，EBV+ B细胞频率显著升高；去除CD8 T细胞未造成明显变化，提示CD4 T细胞可能限制扁桃体类器官中的EBV+ B细胞扩增。

02 研究内容

（1）人扁桃体类器官模型的建立与EBV感染动力学评估

图1. 扁桃体类器官中EBV+ B细胞的评估 。(A) 实验工作流程图。扁桃体组织经机械解离为单细胞悬液，低温保存后复苏接种，加入GFP标记的EBV（Akata株），在4小时、2天、5天、7天及14天进行流式细胞术评估。(B) 第14天代表性流式图及EBV+ B细胞动力学曲线（n=3，0.0005 MOI）。(C) 第14天EBV+ B细胞频率（n=40），血清阴性供者来源类器官中感染频率较高。(D) naive或memory B细胞去除对第14天EBV+ B细胞频率的影响（n=6）。(E) 未感染与EBV感染类器官中活化CD4及CD8 T细胞（CD38+HLA-DR+）频率（n=40）。(F) 供者年龄与EBV+ B细胞频率的相关性（n=40，Spearman R=–0.4101，P=0.0086）。(G) EBV血清阴性与血清阳性供者来源类器官中EBV+ B细胞频率比较（n=16；7例血清阴性，9例血清阳性，P=0.0418）。

为了系统评估类器官技术在EBV感染研究中的适用性，研究团队建立了一套标准化的组织处理、单细胞分离、低温保存与三维培养方案。在实验周期内，研究人员从40名扁桃体切除术后供者获得/收集了标本（多为阻塞性睡眠呼吸暂停或扁桃体肥大患者，组织外观正常），涵盖不同年龄、性别及EBV血清学状态[图1A；附表S1]。

根据图1所示的实验流程，该类器官体系支持EBV的有效感染与追踪。感染动力学数据显示，EBV+ B细胞在感染极早期（4小时至7天）频率较低（中位频率0–0.019%），但在第14天可扩增至中位0.81%（n=40，P=1.819×10⁻¹²）[图1B–C]。这种"延迟扩增"模式与既往扁桃体外植体研究较为一致，提示EBV在生理淋巴组织中可能经历一个相对静默的阶段后，在组织微环境支持下实现克隆扩增。

进一步分析提示两个可能影响感染频率的因素：其一，供者年龄与EBV+ B细胞频率呈负相关（Spearman R=–0.4101，P=0.0086），年龄较大者感染频率较低 [图1F]；其二，EBV血清阳性供者来源的类器官中，EBV+ B细胞频率低于血清阴性供者（P=0.0418）[图1G]。上述结果提示，类器官可能部分保留与供者既往EBV暴露相关的回忆性免疫反应，从而限制EBV+ B细胞感染和/或扩增；具体由抗体、记忆T细胞还是其他因素介导，仍需进一步验证。

在B细胞感染靶点方面，传统观点认为EBV优先感染naive B细胞。该研究通过FACS分选去除naive B细胞或memory B细胞发现，去除naive B细胞后EBV+ B细胞频率升高（P=0.0313），而去除memory B细胞后感染率无显著变化[图1D]。该现象提示，在扁桃体微环境中，naive与memory B细胞可能均对EBV具有易感性，但两类细胞之间可能存在一定的竞争关系或占据不同的空间生态位。当naive B细胞被移除后，memory B细胞可能获得更多感染机会。

T细胞应答方面，EBV感染未显著改变CD4及CD8 T细胞总频率，但活化表型（CD38+HLA-DR+）比例 modestly 升高（CD4：P=0.0360；CD8：P=0.0058）[图1E]。上清转移实验提示类器官中的EBV复制有限；T细胞活化可能与潜伏期或裂解期病毒蛋白的表达和可及性有关，具体机制尚未确定。

（2）EBV+ B细胞表型特征、GC分区定位与免疫代谢标志物变化

基于CD38、CD27和IgD的经典分型，第14天的EBV+ B细胞多数已呈现活化pre-GC或GC样表型，少数表现为浆母细胞特征 [图2A]。这种表型转换具有一定的组织特异性：平行实验显示，外周血单个核细胞（PBMC）来源的类器官感染效率较低，而脾细胞来源类器官中pre-GC表型比例低于扁桃体，提示扁桃体微环境可能对EBV感染B细胞的GC样分化具有独特的支持作用 [附图S2A]。

免疫荧光定位显示，大多数GFP⁺ EBV+ B细胞位于CD10⁺ GC结构之外，但仍有少量细胞可在GC内部被检测到；流式检测也证实EBV+ B细胞表达CXCR5，但水平低于未感染B细胞 [附图S2D–F]。这表明EBV+ B细胞虽保留部分滤泡驻留能力，但其空间定位可能已发生偏移。

在GC分区偏好方面，EBV+ B细胞在亮区表型（CD83⁺）中比例较高（P=2.47×10⁻³），而暗区表型（CXCR4⁺）频率与未感染细胞差异无统计学意义（P=0.113）[图2D]。这种亮区偏好可能具有功能意义：EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A分别模拟CD40和BCR信号，可能使感染B细胞在不依赖高亲和力抗原的情况下，持续获得类似亮区的存活信号。研究者推测，这种"亮区样状态"可能通过增强子环化上调抗凋亡基因BCL2A1，从而赋予感染细胞一定的生存优势。与此同时，暗区频率未明显增加，提示EBV可能部分规避了传统GC的亲和力成熟周期。

表面标志物分析显示EBV+ B细胞存在免疫代谢相关变化：CD21（EBV糖蛋白gp350的附着受体）表达升高（P=2.80×10⁻⁷），可能有利于EBV附着；CD39（胞外核苷酸酶）表达升高，而CD73表达降低（P=5.99×10⁻⁴）[图2C]。CD39⁺CD73⁻表型提示EBV+ B细胞可能促进胞外ATP/ADP向AMP转化，并可能降低进一步生成腺苷的能力；其实际代谢和免疫调节作用仍需功能实验验证。

（3）单细胞转录组学揭示EBV+B细胞异质性与低BCL6特征

图3.原发感染中EBV+B细胞的转录组景观。(A)EBV感染类器官B细胞簇中GFP转录本的检测。(B)按感染条件与时间分层的UMAP图。(C)全部B细胞UMAP（63,263个细胞，n=4血清阴性供者），EBV相关簇加粗标注。(D)定义B细胞簇身份的DEG点图。(E)未感染与EBV+类器官中各B细胞簇频率随时间变化（n=4）。(F)EBV感染类器官B细胞簇中各Topic权重（干扰素、核糖体生物合成、增殖、B细胞活化）。

为深入解析感染B细胞的分子状态，研究者对4例EBV血清阴性供者的类器官进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），覆盖89,444个细胞（含63,263个B细胞）。B细胞亚群聚类鉴定出21个簇，其中11个与EBV感染相关，分布于GC样、浆母细胞和增殖表型 [图3A–C]。

时间维度分析显示，EBV+ B细胞在第14天和第21天发生较为显著的转录重编程，与未感染细胞的转录谱差异较大 [图3B–D]。这提示EBV驱动的B细胞命运改变可能是一个渐进且深刻的过程。与SoRelle等人（2022）报道的PBMC来源EBV+ B细胞数据进行比对时，仅约20%的簇在转录水平上存在较明显的重叠。定量比较中约20%的细胞簇可较好匹配，另有若干簇仅呈定性或部分相似；这提示扁桃体淋巴组织来源与PBMC来源的EBV+ B细胞状态存在明显差异，但不能简单概括为没有对应物或存在本质区别。

与经典GC B细胞不同，大多数EBV+ GC样B细胞低表达BCL6（GC主转录调控因子）。这与既往研究较为一致：EBV编码的EBNA3C和病毒miRNA可能通过靶向降解或表观遗传抑制下调BCL6。BCL6的降低或许使EBV+ B细胞部分绕过GC检查点，避免进入正常的分化终末阶段，从而可能维持其增殖和存活优势。然而，部分EBV+ GC样簇仍保留传统GC特征基因，如AICDA和MCM2–7，提示EBV可能选择性利用了GC的增殖和重组程序。

Topic建模识别出15个关键转录程序，其中在EBV+ B细胞中权重较高的包括干扰素（IFN）反应（Topic K6）、核糖体生物合成（Topic K11）及增殖程序（Topic K15）[图3F]。干扰素反应在多个GC样簇中权重较高，且随时间推移在旁观者B细胞中逐渐增强，提示局部抗病毒信号可能存在持续扩散。增殖程序与MKI67、STMN1等基因共表达，且主要见于EBV+细胞。值得注意的是，四个增殖簇中仅Prolif4（及轻度Prolif2）共表达CD70和ENTPD1（CD39），这与近期人源化小鼠模型中描述的高增殖EBV+ B细胞部分相似，但扁桃体类器官中EBV+ B细胞的异质性似乎更高。

（4）BCR谱系追踪：类别转换与体细胞高频突变的解偶联现象

图4. 扁桃体类器官EBV+B细胞的克隆性与同型使用。(A)第14天EBV+与未感染B细胞的抗体同型使用UMAP映射（4例供者）。(B)第14天未感染、EBV未感染及EBV+ B细胞中类别转换频率。(C)第14天IGHG1+ B细胞中SHM频率比较（95%CI）。(D) EBV血清阴性供者第14天EBV感染与未感染类器官的BCR谱系多样性。(E) 克隆扩增相关的转录组特征。(F)含至少一个EBV+ B细胞的克隆谱系大小分布。(G) 感染后简单克隆扩增示例。(H) 具有较复杂SHM和类别转换的GC样克隆谱系示例。

BCR测序显示，在第14天，约40%的EBV+ B细胞已完成类别转换（以IgG和IgA为主），而同一类器官中未感染B细胞及对照类器官未感染B细胞的转换率约为10–15%（P=0.043）[图4A–B]。这一较高的类别转换率可能与LMP1模拟CD40信号等机制有关；AICDA可能参与其中，但具体因果机制仍待验证。

为区分"感染前已转换的B细胞更易被感染"与"EBV直接诱导转换"两种可能性，研究者按同型比较了SHM频率。主要发现如下：在IGHG1+细胞中，EBV+ B细胞的SHM频率低于同一类器官中的未感染IGHG1+ B细胞（P=5.76×10⁻⁸），也低于独立对照类器官的未感染IGHG1+ B细胞（P=2.01×10⁻⁷）[图4C]。仅在IgM+群体中观察到EBV+细胞SHM略高，但总体SHM率较低。这种"高CSR、低SHM"的表型组合提示EBV或许能够在不引发广泛BCR突变的情况下，驱动B细胞发生抗体类别转换。这种CSR与SHM的解偶联可能有利于EBV持续存在，因为广泛SHM可能增加病毒双链DNA发生有害突变的风险；这仍属于机制推测。BCR谱系分析显示，EBV感染可能增加了B细胞克隆扩增和谱系多样性 [图4D]。扩增克隆主要富集于EBV+ pre-GC、GC和增殖簇 [图4E]。然而，在3,437个含≥6个细胞的EBV+克隆谱系中，约99%（3,408个）为简单扩增谱系，成员间SHM较少；仅约0.84%（29个谱系）表现为较复杂的GC样谱系，具有多级分支、较明显的SHM和谱系内类别转换 [图4G–H]。这29个谱系的存在提示，确有少数EBV+ B细胞可能进入并经历较为典型的GC反应，为EBV感染的"GC模型"提供了一定的实验依据。但大多数EBV+ B细胞似乎通过GC外或非典型GC途径进行扩增和CSR。

（5）T细胞应答特征与CD4/CD8耗竭功能验证

图5. 扁桃体类器官中T细胞对EBV。(A)EBV血清阴性供者T细胞亚群聚合UMAP（18,707个细胞，n=4）。(B)未感染与EBV感染类器官中T细胞转录组分布。(C)EBV感染与对照类器官中活化相关CD4 T细胞簇频率随时间变化（n=4）。(D)未感染与EBV感染类器官上清中分泌型细胞因子水平（n=4）。(E) EBV感染类器官中CD4与CD8 T细胞亚群的Topic权重。(F)第14天CD4 T细胞存在或缺失时EBV+ B细胞频率（血清阴性n=7，血清阳性n=10）。(G)第14天CD8 T细胞存在或缺失时EBV+ B细胞频率（血清阴性n=9，血清阳性n=5）。

同步的单细胞T细胞分析（18,707个CD3+细胞，15个簇）显示，EBV感染未诱导全新的T细胞亚群，但改变了现有亚群的比例。第14天时，活化的CD4 T细胞和表达ISG的GC-T滤泡辅助细胞（GC-TFH）比例呈上升趋势（因样本量限制未达统计学显著），与EBV+ B细胞扩增高峰在时间上同步 [图5C]。

细胞因子检测显示，感染类器官上清中IFN-α2、MIP-1α、RANTES和TNF-β升高，IL-10有轻微上升趋势 [图5D]。Topic分析进一步揭示，干扰素反应程序在多数T细胞亚群中被诱导，而核糖体生物合成程序在部分CD4/CD8亚群中下调，可能反映了IFN介导的抗病毒代谢重编程 [图5E]。T细胞 repertoire 分析显示CD4与CD8 T细胞克隆性未发生显著变化，提示在21天观察期内T细胞应答可能以转录活化而非大规模克隆扩增为主。

为验证T细胞亚群的功能，研究者在来自EBV血清阴性和血清阳性供者的类器官中分别进行CD4或CD8 T细胞去除实验：去除CD4 T细胞后，EBV+ B细胞频率在血清阴性供者中升高（P=0.0156），在血清阳性供者中升高更为明显（P=0.0019）[图5F]；去除CD8 T细胞后，EBV+ B细胞比例未显著改变（血清阴性P=0.0856；血清阳性P=0.0625）[图5G]。上述结果提示，在扁桃体原发感染早期微环境中，CD4 T细胞可能是限制EBV+ B细胞扩增的重要因素之一；这一作用在继发感染中可能由记忆CD4 T细胞介导，在初发感染中可能由新激活的或旁观者CD4 T细胞参与。

研究者推测，CD8 T细胞作用不明显可能与以下因素有关：本研究使用的EBV接种量较低，裂解复制受限，导致CD8 T细胞（通常靶向裂解期抗原）活化不足；此外，儿童供者（<13岁）的原发感染通常症状较轻或呈无症状，其扁桃体CD8 T细胞可能尚未达到IM患者中的扩增水平。既往研究提示，CD4 T细胞可能通过识别潜伏期/裂解期抗原、分泌细胞因子或发挥细胞毒性参与控制EBV；本研究主要支持CD4 T细胞对EBV+ B细胞扩增具有抑制作用，具体机制尚待验证。

（6）整合工作模型与体内外一致性评估

图6.人扁桃体类器官中原发EBV感染的工作模型。感染后B细胞获得多样表型，部分呈GC样。大多数感染细胞位于典型GC之外，发生类别转换并经历适度增殖而无明显BCR突变，形成多个小型克隆扩增。少数EBV+B细胞位于GC内并参与SHM，形成较复杂的克隆谱系。两类细胞均可分化为EBV+浆母细胞，但向长期静息记忆B细胞的分化路径尚不清楚。CD4T细胞对EBV+B细胞扩增具有抑制作用。

基于上述多维度数据，作者提出了EBV原发感染的一种整合工作模型 [图6]。该模型描述了EBV感染扁桃体naive、pre-GC及memory B细胞后，感染B细胞较快获得GC样或pre-GC表型，但主要定位于GC外（滤泡外或边缘区样区域）。大部分EBV+ B细胞通过亮区样状态存活，进行类别转换，并形成较多小型克隆扩增，但SHM不明显。少数EBV+ B细胞（约0.84%的克隆谱系）可能真正进入GC，经历SHM和较复杂的克隆演化。CD4 T细胞通过分泌IFN、TNF等细胞因子及可能的直接接触，对EBV+ B细胞扩增产生限制作用。感染B细胞最终可能分化为浆母细胞或向记忆B细胞池过渡，但后者在本模型的观察期内尚未被明确捕获。

该模型为理解EBV如何利用部分GC样程序促进感染细胞扩增、同时偏离典型GC分化路径，并可能有利于病毒持续存在，提供了一个工作性解释框架；持续潜伏和免疫逃逸机制仍需进一步验证。

3.挑战与局限

本项由UCI与哈佛团队发表于《PNAS》的研究工作，成功建立了一种生理相关度较高的EBV原发感染体外研究模型。然而，结合该研究的具体实践，该模型体系仍存在一定需要持续优化的技术边界与局限：

（1）记忆B细胞储存库未在观察期内明确显现：在3周培养期内，研究者未检测到明确的EBV+记忆B细胞群。这可能因为培养时间不足以完成从GC到记忆的完整分化，也可能因为进入记忆状态的EBV+ B细胞充分沉默病毒基因表达，从而与未感染记忆B细胞难以区分。

（2）组织成分代表不足：类器官中的扁桃体上皮代表不足，主要抗原提呈细胞群体也低于体内状态；因此难以评估这些细胞对EBV感染和免疫应答的相对贡献。这使得研究者无法评估上皮细胞在病毒初始入侵中的作用，也限制了对天然免疫识别过程的完整观察。

（3）裂解复制有限：与既往扁桃体外植体模型相比，本研究类器官中的EBV裂解复制较为有限；这一特点可能限制CD8 T细胞应答，并使病毒产生、传播及裂解复制周期的研究受到限制。

4.总结与展望

该研究基于40名供者的扁桃体类器官建立EBV感染模型，证明其可用于观察原发感染早期B细胞状态、BCR谱系动态及T细胞应答；其在不同供者免疫背景下预测感染/免疫应答的能力，以及长期分化终点，仍需进一步验证。