肝脏类器官证实：两种安全的脂肪酸联用，不伤健康肝，只伤MASH肝脏！

为探究代谢状态对肝细胞脂毒性敏感性的影响，研究在MCS正常培养基与MCD代谢紊乱培养基中，分别用LA-m、LA-l单独或联合处理AML12、HepG2细胞及小鼠原代肝细胞。结果显示，MCS条件下，两种脂肪酸单独或联用均未显著改变AML12细胞活力（图1A、1B）；MCD条件下，单独脂肪酸无明显影响，但LA-m与LA-l联用显著降低细胞活力。在HepG2细胞（图1C、1D）与小鼠原代肝细胞（图1E-1G）中均得到一致结果。综上，MCD培养基诱导的代谢紊乱使肝细胞对LA-m与LA-l联合暴露诱导的毒性更敏感。

肝脏类器官先经扩增与分化培养（图2A），免疫荧光结果显示，肝细胞特征标志物HNF4α在细胞核高表达，成熟转运体MRP2正确定位于类器官外缘，证明类器官分化成熟（图2B）。将成熟类器官分别置于MCS与MCD培养基中给予脂肪酸处理，结果如图2C、2D所示：MCS条件下，LA-m、LA-l单独或联用均不影响类器官活力；MCD条件下，二者联用显著降低细胞活力。该结果为人源代谢紊乱状态下LA-m与LA-l联合暴露诱发肝毒性提供了更具临床相关性的证据。

图3. 月桂酸与亚油酸联合可加重MCD饮食诱导的肝脏脂肪变性与肝毒性，但对正常饮食小鼠无影响。正常饮食（ND）组：(A)正常饮食小鼠实验设计示意图。(B)实验期间隔日测定小鼠体重。(C)平均摄食量。(D–G)实验结束时肝脏甘油三酯（TG）、肝脏非酯化脂肪酸（NEFA）、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。(H,I)肝脏组织H&E染色（H）与油红O染色（I）；放大倍数×200；标尺：100 μm。MCD饮食组：(J)MCD饮食小鼠实验设计示意图。(K)3周内隔日测定小鼠体重。(L)平均摄食量。(M–P)实验结束时肝脏TG、肝脏NEFA、血清ALT、AST水平。(Q–T)肝脏组织H&E染色（Q）与肝脏NAS评分（R）；油红O染色（S）与肝脏脂质阳性面积（T）；放大倍数×200；标尺：100 μm。

4. 肝脏脂质代谢紊乱参与LA-m与LA-l联合暴露加剧的肝毒性

为解析LA-m与LA-l组合诱导肝毒性的机制，该研究采用基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的脂质组学技术，检测健康或MCD饮食诱导的MASH状态下，单一脂肪酸或二者组合诱导的脂质代谢变化，结果显示PCA可清晰区分正常饮食与MCD饮食小鼠的脂质分布（图4A），模型稳定有效。MCD饮食本身显著升高肝脏TG（图4B），在此基础上，LA-m与LA-l联用进一步增加TG种类与含量（图4C、4D），同时显著升高鞘脂（Cer、SM）与甘油磷脂（PC、PI、PS、PE）水平（图4E-4J），且PE中富集AA与AdA侧链（图4K），综上，MCD饮食诱导的MASH状态下，LA-m与LA-l联合干预可显著扰乱肝脏脂质代谢，可能参与该组合诱导的肝毒性。

图4. 月桂酸与亚油酸联合可诱导MCD饮食小鼠肝脏甘油三酯、鞘脂与甘油磷脂蓄积，进而加重肝毒性。(A–K)LA-m与LA-l联合对肝脏磷脂的影响。小鼠经LA-m（350 mg/kg）、LA-l（1000 mg/kg）单独或联合处理3周，采用液相色谱串联质谱（LCMS/MS）分析脂质组成。(A)正常饮食与MCD饮食小鼠肝脏脂质分布的主成分分析（PCA）。(B)热图显示MCD饮食小鼠较MCS饮食小鼠甘油三酯（TG）倍数变化。(C)热图显示LA-m、LA-l单独或联合在MCD与正常饮食条件下TG倍数变化。(D)MCD饮食小鼠不同甘油脂（GL）相对变化（n=5）。(E)热图显示LA-m、LA-l单独或联合在MCD与正常饮食条件下鞘脂（SP）与甘油磷脂（GP）倍数变化。(F–J)MCD饮食小鼠不同SP与GP（E）、神经酰胺（Cer）与鞘磷脂（SM）（F）、磷脂酰胆碱（PC）（G）、磷脂酰肌醇（PI）（H）、磷脂酰丝氨酸（PS）（I）、磷脂酰乙醇胺（PE）（J）相对变化（n=5）。(K)脂质脂肪酸侧链统计。

5. 鞘脂积累诱导的内质网应激是LA-m与LA-l组合在体内外诱导肝毒性的主要驱动因素

脂质组学结果显示，MCD诱导的MASH模型中，LA-m与LA-l联用会造成肝脏鞘脂积累。为验证其作用，采用鞘脂合成抑制剂ISP-1处理HepG2细胞，结果显示ISP-1可显著逆转两种脂肪酸联用导致的细胞活力下降（图5A），证实鞘脂蓄积参与该组合诱导的肝毒性。

已有研究表明内质网应激与脂毒性密切相关，因此该研究检测了相关通路蛋白。结果显示，LA-m与LA-l联用可显著上调p-eIF2α/eIF2α、p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK的表达（图5B、5C）；使用IRE1α或JNK抑制剂均可恢复AML12和HepG2细胞的活力（图5D、5E）。

机制上，ISP-1能够下调p-IRE1α/IRE1α和p-JNK/JNK水平（图5F），说明内质网应激激活发生在鞘脂积累的下游。动物实验显示，该联用仅在MCD饮食小鼠肝脏中激活内质网应激（图5G、5H），在正常饮食小鼠中无此效应（图5I）。

结果表明，鞘脂积累介导的内质网应激激活是LA-m与LA-l联用诱发肝毒性的核心机制。

图5. MCD条件下月桂酸与亚油酸联合诱导鞘脂蓄积，进而在体内外上调内质网应激相关蛋白水平。(A)HepG2细胞在存在或不存在ISP-1时，经LA-m、LA-l单独或联合处理24 h，检测细胞活力。(B,C)AML12细胞（B）与HepG2细胞（C）经LA-m、LA-l单独或联合处理24 h后，采用蛋白质印迹法检测p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK的相对表达与定量分析。(D,E)AML12细胞（D）与HepG2细胞（E）在存在或不存在4μ8c与SP600125时，经LA-m、LA-l单独或联合处理24h，检测细胞活力。(F)HepG2细胞在存在或不存在ISP-1与LA-m、LA-l单独或联合处理24 h后，p-IRE1α/IRE1α与p-JNK/JNK水平。(G–I)采用蛋白质印迹法检测MCD饮食（G,H）与正常饮食（I）小鼠肝脏组织裂解液中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK蛋白水平。

6. 铁死亡参与LA-m与LA-l联合暴露加剧的MASH进展

铁死亡是由脂质过氧化驱动的细胞死亡，AA/AdA-PE是诱发铁死亡的关键磷脂。该研究脂质组学发现，MCD条件下LA-m与LA-l联用可显著升高AA/AdA-PE含量，提示铁死亡可能参与其肝毒性过程。

进一步分子机制验证显示，LA-m与LA-l联用可显著上调AML12和HepG2细胞中铁死亡关键蛋白ACSL4、TFR1的表达（图6A、6B）；在MCD饮食小鼠肝脏中也出现一致变化（图6C、6D），但正常饮食小鼠无此效应（图6E）。使用铁死亡抑制剂Lip-1可部分恢复细胞活力（图6F），并降低脂质过氧化物LPO水平（图6G、6H）。

亚油酸作为花生四烯酸（AA）的前体，LA-m可能通过促进亚油酸的酯化作用使肝细胞对铁死亡更敏感。这也与已有研究结论一致。

综上，MCD条件下，铁死亡在LA-m与LA-l联用诱导的肝毒性中发挥重要作用。

图6. MCD条件下月桂酸与亚油酸联合暴露可在体内外上调ACSL4与TFR1表达，进而加重MASH进展。(A–E)经LA-m、LA-l单独或联合处理后，检测AML12细胞（A）、HepG2细胞（B）、MCD饮食小鼠（C,D）与正常饮食小鼠（E）中ACSL4与TFR1的相对表达及定量分析。(F)AML12细胞经1 μM Lip-1预处理6 h，再经LA-m、LA-l单独或联合刺激24h，评估细胞活力。(G,H)采用Liperfluo试剂盒定量检测LA-m与LA-l联合在MCD培养基中诱导AML12细胞（G）与HepG2细胞（H）的脂质过氧化物（LPO）水平上调。

04 研究结论

LA-m与LA-l组合在MCD饮食诱导的MASH小鼠模型中加重肝毒性，机制为鞘脂积累介导的内质网应激和甘油磷脂积累驱动的铁死亡（图7）。该研究结果为制定MASH患者饮食指南提供新依据。

图7. 月桂酸与亚油酸联合摄入加重MASH小鼠肝毒性但对健康小鼠无影响的机制示意图。在MASH状态下，LA-m与LA-l联合诱导鞘脂（SP）蓄积，激活内质网应激并最终触发铁死亡；同时，该组合使甘油磷脂（GP）水平升高，进一步驱动铁死亡。

05 未来展望

该研究初次清晰揭示了月桂酸与亚油酸联合摄入会特异性加重代谢相关脂肪性肝炎（MASH）肝毒性，并系统阐明鞘脂蓄积—内质网应激—铁死亡的核心损伤通路，为MASH人群膳食脂肪酸安全评估与临床干预提供了颇具转化价值的新方向。未来可进一步围绕LA-m/LA-l诱导脂质紊乱的上游调控机制深入挖掘，重点解析丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）及鞘脂、铁死亡相关关键酶的调控作用。同时依托该研究中发挥重要验证作用的人源肝脏类器官(大橡科技）平台，构建“膳食脂肪酸组合筛查—类器官毒性验证—代谢人群风险分层"的标准化全链条研究体系，在高度仿生的3D模型上快速评估不同脂肪酸比例、不同中链脂肪酸组合对肝细胞的影响，大幅提升脂毒性预测的准确性与临床相关性。此外，针对性开发靶向鞘脂代谢、内质网应激与铁死亡通路的干预策略，最终将基础研究成果转化为可用于MASH患者膳食风险预警、毒性评估与精准营养管理的临床应用方案，真正为代谢性肝病高危人群提供更安全、更科学的膳食指导。