重磅合作文章 | 无泵肠-肝类器官芯片动态解析药物性肝损伤与药物相互作用

近日，中检院国家药物安全评价监测中心、北京协和医学院、中国药科大学、大橡科技等单位合作，在微流控领域专业期刊《Lab on a Chip》发表肠—肝器官芯片研究成果，论文题为《Gut–liver-on-a-chip enables mechanistic study and risk assessment of drug-induced liver injury and drug–drug interactions》的封面文章。

药物性肝损伤（DILI）是导致临床试验失败及药物上市后退市的重要原因之一，也凸显了传统临床前动物模型在预测人体反应方面的局限性。口服给药是新分子实体最主要的给药途径之一。依据ICH安全性指导原则，毒性研究的给药途径应尽可能与临床拟用途径保持一致。然而，单一体外模型难以真实还原药物口服后经肠道吸收、进入肝脏代谢，并由此引发毒性反应的复杂过程。

针对这一难题，研究团队构建了一种无泵型肠-肝器官芯片（OoC），将极化肠道屏障与四种细胞共培养形成的肝球状体整合于同一系统，实现了药物暴露、毒性反应及器官间药理相互作用的一体化分析。

该平台可模拟口服给药与系统给药情境。研究结果表明，肠道屏障能够调节药物暴露水平、肝毒性反应及首过效应；平台还可在体外重现CYP酶和转运体介导的两类药物相互作用，并动态追踪肝损伤相关指标随时间的变化。研究突破了以往肠芯片主要用于药物吸收与通透性研究、肠-肝芯片较少应用于DILI评价的局限，为小分子药物肝毒性及药物相互作用的机制研究与风险评估，提供了更具人体生理相关性的补充性体外模型。

01 研究亮点

1.构建包含极化肠道屏障与四细胞共培养肝球状体的无泵型肠-肝器官芯片，弥补单一体外模型无法还原口服后肠肝交互的缺陷。

2.依托芯片对两类药物相互作用进行了概念验证：一方面，结果支持CYP介导的生物活化参与APAP肝毒性；另一方面，平台在体外重现了转运体相关的药物相互作用。

3. 建立多维度评价体系，用于分析药物暴露与毒性反应之间的关系、追踪毒性随时间的进展，并模拟药物相互作用。

02 研究内容

1.肠道芯片模型的构建

研究采用大橡科技IBAC®（Integrated Biomimetic Array Chip，仿生阵列芯片）M1芯片构建肠道芯片模型，并对其进行系统表征。如图1A所示，IBAC®M1芯片（型号ME102411）采用无泵式双器官芯片设计，可实现肠道细胞与肝类器官的共培养。通道与两个储液槽。实验前将芯片固定于配套精密摇床（大橡科技），通过精密摇床为流体通道提供0.45dyn・cm⁻²的流体剪切力（图1B）。通过翻转芯片，可将肠道细胞接种于膜上侧或下侧，两种方式均可形成连续完整的肠道屏障（图1C）。针对肠-肝芯片体系，本研究初步验证了肠-二维肝芯片的功能，但主要以肠-三维肝球状体芯片（图1D）为研究载体；药物暴露与毒性监测、时间依赖性毒性演变、药物相互作用介导毒性效应等概念验证实验均在肠-三维肝芯片中完成。给药后采用液相色谱测定药物浓度，借助酶标仪、倒置显微镜、高内涵细胞成像分析仪检测药物毒性指标（图1E）。

图1为IBAC®️M1芯片模型结构与工作原理示意图，其中（A）为芯片整体结构，该芯片包含由多孔膜分隔的上下两个腔室，可实现两种器官等效物的共培养；（B）为动态培养条件设置，通过间歇摇摆产生流体剪切力，设定摇摆频率为每分钟1个循环、倾斜角度小于30°，本实验选用20°倾角开展实验；（C）为单一肠道芯片模式图；（D）为肠-肝共培养芯片模式图；（E）为芯片检测原理，给药后可收集腔室培养液检测药物浓度变化与生化标志物，同时可对腔内类器官原位采用各类荧光探针与特异性抗体完成毒性检测。

研究将肠道细胞接种于膜上侧或膜下侧，细胞贴附于膜表面后形成多层复合结构（图2A）。跨上皮电阻（TEER）数值在4周培养周期内总体呈升高趋势（图2B、C）。随后通过测定荧光素钠表观渗透系数（Papp）评价肠道屏障完整性：参考既往文献，荧光素钠表观渗透系数低于5×10⁻⁷ cm·s⁻¹可视为低通透性。该实验所有肠道芯片模型的Papp值均满足该标准（图2D、E）。两种细胞接种方式均证实肠道屏障结构完整。由于该试验需使肝类器官处于动态流体环境中，后续实验统一将肠道细胞接种于膜上层。培养全程肠道屏障层结构保持完整；单层接种的Caco-2/HT29-MTX-E12混合细胞（图2A）不断增殖，最终形成多层上皮结构（图2F）。培养第14天，肠道细胞即可连续表达连接蛋白ZO-1与闭合蛋白（occludin），且维持至第21天（图2G、I）。此外，P-糖蛋白（PGP）、多药耐药相关蛋白2（MRP2）两类转运体主要分布于肠道屏障顶侧膜（图2J）。PGP底物罗丹明123（Rho123）表现出较强的基底侧至顶端侧外排，支持该肠道屏障具有极性和外排转运功能（图2H）。上述结果表明，IBAC®️M1芯片可构建出极化肠道屏障，且该屏障在培养第14～21天保持结构稳定。

图2为基于IBAC®️M1芯片构建的肠道芯片模型，其中（A）为细胞分别接种于膜上侧与膜下侧后第7、14、20、30天的细胞形态结果；（B、C）分别为细胞接种于膜上侧和膜下侧时肠道芯片跨上皮电阻（TEER）的时序变化曲线；（D、E）分别为两种接种方式下肠道芯片的荧光素钠表观渗透系数（Papp）检测结果；（F）为培养第14天与21天样本的苏木精-伊红（HE）染色结果；（G）为10倍镜下培养第14、21天肠道屏障紧密连接蛋白ZO-1（橙红色）、闭合蛋白occludin（绿色）及细胞核（蓝色）的荧光染色图像（比例尺=100μm）；（H）为第14天罗丹明123（Rho123）跨膜转运检测结果；（I）为40倍镜下肠道紧密连接ZO-1与occludin的荧光染色图；（J）为40倍镜下转运体P-糖蛋白（PGP）、多药耐药相关蛋白2（MRP2）及细胞核的荧光染色结果；本实验样本量为3–6组，所有数据均以平均值±标准差（mean±SD）表示。

2.肠-肝一体化芯片构建后细胞活力与功能评价

本研究持续两周观察肝球状体的形态与生理功能。活/死细胞双染结果显示，随培养时间延长，死亡细胞数量逐渐增加；第14天的死亡细胞数量高于第4、7和10天。糖原染色（PAS染色）可观察到糖原沉积；白蛋白（ALB）总分泌量与单位细胞白蛋白分泌量均随培养时间延长逐步升高，提示肝细胞合成代谢功能持续增强。为评价肝细胞损伤程度，研究检测了上清中AST、ALT及LDH的释放水平；第10天上清中AST和ALT水平升高。免疫荧光结果显示，CYP3A4蛋白表达于肝球状体内部，多药耐药相关蛋白2（MRP2）与P-糖蛋白（PGP）分布于球状体边缘细胞膜。上述结果反映两周培养周期内各项肝脏功能标志物的本底表达水平。

肠道模型培养至第14天时，将肝类器官接种于膜基底侧，按照实验时序搭建肠-肝芯片共培养体系（图3A）。三维肝球状体可轻度黏附于动态培养腔底部，并在流体通路环境中维持稳定生长（图3B）。二维、三维肝细胞培养是构建肝类器官的两种主流方案。本研究将两套双器官体系维持共培养7天，对比肠-二维肝芯片与肠-三维肝芯片的肠道屏障完整性、肝细胞功能及损伤状态。接入肝类器官后，肠-肝芯片的跨上皮电阻（TEER）持续上升，变化趋势与单一肠道芯片一致，说明肠道上皮紧密连接持续形成（图3C）。共培养第6天，单一肠道芯片与肠-三维肝芯片的荧光素钠平均表观渗透系数（Papp）均符合屏障完整性标准（图3D）；荧光染色可见肠-肝芯片中紧密连接蛋白ZO-1、闭合蛋白（Occludin）连续完整（图3G），肠道腔室内LDH释放量维持稳定。

以上结果表明：无论是否共培养肝模块、无论采用二维或三维肝细胞模型，肠道屏障均可维持完整结构。随后通过多项肝脏功能与损伤指标，对比肠-二维肝芯片、肠-三维肝芯片的肝脏功能及稳态水平。两组肝腔尿素（UREA）、AST、ALT（图3E）水平无统计学差异；但共培养第2～4天，肠-三维肝芯片的白蛋白分泌量显著更高（图3E）。肠-二维肝芯片接种的肝细胞总数略高于三维体系，三维肝细胞模型的肝脏功能优于二维单层模型。两种方案均可构建成熟稳定的肠-肝共培养芯片，后续实验统一选用三维肝球状体搭建共培养体系。接入肝类器官后，将双器官体系继续共培养7天，全程监测组织形态、细胞活力、系统稳态，以及药物转运与代谢活性。图3B为共培养7天后明场形态；图3F展示共培养第3、5、7天活/死细胞分布。本研究同步对比三组体系肝球状体的代谢酶与转运体表达：肠-肝共芯片、单一肝芯片、U型底静态培养板。结果显示：静态/动态流体培养模式显著改变CYP2D6（P＜0.05）、ABCC2（P＜0.05）表达；单器官/肠肝共培养体系影响ABCC1（P＜0.01）、ABCC2（P＜0.05）、ABCC3（P＜0.05）表达。结合TEER结果（图2B、C及图3C）、ZO-1与occludin荧光信号（图2G及图3G）以及相关基因表达结果，单一肠道芯片与肠-肝芯片的肠道屏障完整性未见明显差异。最后检测肝腔中CYP3A4、MRP2、PGP、增殖标志物Ki67、紧密连接ZO-1、胆汁盐输出蛋白BSEP的蛋白表达（图3H、I），证实上述关键功能蛋白均可正常表达。

图3为肠-肝一体化芯片体系的构建、细胞活力检测及类器官功能评价结果，其中（A）为肠-肝芯片的构建实验时序图；（B）为共培养第7天肠-三维肝芯片的明场成像图（比例尺=2mm）；（C）为单一肠道芯片、肠-二维肝芯片及肠-三维肝芯片的跨上皮电阻（TEER）变化曲线；（D）为培养第6天单一肠道芯片与肠-三维肝芯片的荧光素钠表观渗透系数（Papp）对比结果；（E）为三组模型肝腔中白蛋白（ALB）与丙氨酸氨基转移酶（ALT）的含量检测结果；（F）为U型底培养板与肠-三维肝芯片中类器官的活/死细胞双染结果；（G）为培养第21天单一肠道芯片与肠-三维肝芯片肠道屏障的闭合蛋白occludin（绿色）、紧密连接蛋白ZO-1（橙红色）及细胞核染料DAPI（蓝色）荧光染色图像（比例尺=100μm）；（H、I）分别为肠-三维肝芯片与单一三维肝芯片肝类器官中CYP3A4（绿色）、MRP2（黄色）、PGP（红色）、增殖标志物Ki67（绿色）、ZO-1（黄色）、胆汁盐输出蛋白BSEP（红色）及DAPI（蓝色）的荧光染色结果（比例尺=100μm）；所有数据均以平均值±标准差表示，与肠-二维肝芯片相比，*P＜0.05，样本量n=3。

3.肠-肝芯片中对乙酰氨基酚（APAP）的吸收特性与毒性评价

本研究在单一肠道芯片与肠-肝一体化芯片中，均从肠道顶侧给药模拟口服给药途径。为探究肠道上皮模块对APAP毒性作用的影响，本研究同步检测肠道屏障完整性指标与肝损伤标志物。首先向肠道芯片顶侧单次给予11.1mM APAP。给药后肠道细胞存活率维持在90%以上（图4A），肠道腔乳酸脱氢酶（LDH）释放水平未提示严重细胞损伤（图4B）；跨上皮电阻（TEER）保持稳定（图4C），证明给药后肠道屏障结构完整。上述结果说明该给药剂量下肠道无明显损伤。随后检测肠-肝芯片给药后的TEER变化（图4D）。与单一肠道芯片结果一致，肠-肝芯片TEER无显著下降；给药48h后，对照组与APAP给药组的TEER无统计学差异。在肠道等效物中，各组Rho123、MitoTracker、CellROX和活化caspase-3荧光信号均无显著差异。以上结果表明，给药期间肠道上皮屏障仍保持完整，APAP可跨越肠道屏障进入基底侧肝腔室。为评价肝脏毒性，试验终点检测肠-肝芯片肝腔中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、白蛋白（ALB）及炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。

APAP处理后AST、ALT呈上升趋势，提示出现潜在肝损伤（图4E、F）；白蛋白分泌量下降（图4G），说明肝脏合成功能受损。与口服给药模拟组相比，静脉给药模拟组ALT升高、白蛋白下降及TNF-α升高的趋势更明显（图4H）。研究认为，该差异可能与给药模拟方式有关：在口服给药模拟条件下，肠道屏障延缓APAP进入肝腔，从而降低肝球状体的药物暴露并减轻相关损伤。单一肝脏芯片中白蛋白分泌量下降趋势与静脉给药组相近，且损伤程度重于口服组，同样是由于肝腔直接暴露于高浓度药物所致。为解析APAP诱导肝损伤机制，给药48h后检测线粒体功能障碍、氧化应激与细胞凋亡相关指标（图4J）。采用Rho123与线粒体探针MitoTracker评价线粒体功能：相较于对照组，APAP处理组Rho123荧光强度减弱，提示线粒体膜电位下降；静脉给药组随药物暴露时长、浓度升高，该损伤趋势进一步加剧。MitoTracker荧光显示线粒体分布模式无明显改变。CellROX荧光信号证实APAP处理后细胞氧化应激水平显著升高；促凋亡标志物活化半胱天冬酶-3在APAP各组均阳性表达，证明细胞凋亡通路激活，且静脉给药组荧光信号强度高于口服组。

上述结果表明，肠-肝芯片体系中APAP可诱发肝损伤；静脉给药模拟组药物暴露量更高，肝损伤更严重，从侧面印证肠道屏障能够延缓外源化合物与肝脏的接触。为进一步检验肝毒性差异是否与药物暴露水平有关，本研究从顶侧给予11.1 mM APAP，并监测48h内的药物浓度变化。无细胞接种空白膜组中，给药后肝腔APAP含量快速上升，IBAC®️M1芯片体系24h内药物浓度达到平衡（图4K）；而接种肠道细胞的肠道芯片吸收速率显著放缓（图4L）。图4L、M展示肠-肝芯片的药物吸收过程，单一肠道芯片与肠-肝芯片吸收动力学曲线基本一致（图4N、O）。与空白膜、单一肝脏芯片相比，肠道上皮膜可显著延缓APAP从顶侧向基底侧跨膜转运，降低肝球状体的药物暴露量；该结果与前文结论相互印证，即肠道上皮可缓解APAP对肝球状体的毒性损伤。

图4为单次给予对乙酰氨基酚（APAP）处理48 h后的毒性检测结果，其中图A–C分别为单一肠道芯片模型的细胞活力、肠道腔乳酸脱氢酶（LDH）含量及跨上皮电阻（TEER）变化检测结果；图D为肠-肝芯片模型的TEER变化曲线；图E–H依次为肠-肝芯片肝腔中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、白蛋白（ALB）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的定量检测结果；图I为单一肝脏芯片模型白蛋白含量检测结果；图J为给药终点肝类器官Rho123、线粒体探针MitoTracker、氧化应激探针CellROX及活化半胱天冬酶-3荧光染色肝毒性评估图像（比例尺=100 μm）；图K、L、M分别为空白无细胞隔膜组、单一肠道芯片、肠-三维肝芯片内APAP药物浓度变化曲线；图N、O分别为肠道腔、肝腔中APAP药物浓度变化趋势；本实验样本量n=3，所有数据均以平均值±标准差（mean ± SD）表示，*P＜0.05。

4.肠-肝芯片中时间依赖性肝损伤动态变化观察

在肠-肝一体化芯片体系中，APAP诱导的肝损伤呈时间依赖性，并随肝腔药物暴露水平升高而加重。给药初期各组丙氨酸氨基转移酶（ALT）、白蛋白（ALB）基线水平无明显差异（图5A、5D）。动态监测ALT含量（图5B、5C）可见：给药32小时内ALT已出现可检测的升高趋势，且随时间延长损伤持续加重。

白蛋白水平在给药24 h后开始呈下降趋势，并在后续时间点进一步降低；48h时组间差异达到统计学意义（图5E、5F）荧光检测结果显示，肝损伤程度随药物暴露浓度升高、暴露时长增加逐步加剧：随着APAP暴露时间延长，模型逐渐出现线粒体膜电位下降、ROS信号增强及活化caspase-3信号升高等变化（图5G）。

模拟静脉给药组（APAP i.v.）在给药24h即可观察到TMRE荧光信号显著减弱；而口服给药组（APAP p.o.）该损伤特征延迟至32h才出现，该规律与ROS、活化半胱天冬酶-3的变化趋势充分一致，证明肠道屏障能够延缓APAP诱导肝损伤的发生。结合本研究前期测得的药物浓度-时间曲线，上述结果说明药物暴露时长与肠道屏障共同调控肝脏药物暴露水平。

图5为肠-肝芯片中剂量、时间依赖性肝损伤动态观测结果，其中（A）为0 h丙氨酸氨基转移酶（ALT）基线水平；（B、C）分别为给药24、32、48 h的ALT绝对含量与相对含量检测结果；（D）为0 h白蛋白（ALB）基线水平；（E、F）分别为给药24、32、48 h的ALB绝对含量与相对含量检测结果；（G）为24、32、48 h对照组、口服APAP组、静脉APAP组的氧化应激探针CellROX、线粒体膜电位探针TMRE、活化半胱天冬酶-3荧光染色图像（比例尺=100 μm）；样本量n=3，所有数据均以平均值±标准差（mean ± SD）表示，*P＜0.05。

5.肠-肝芯片用于药物-药物相互作用（DDI）研究

5.1 ABT预处理缓解对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤

针对细胞色素酶介导的药物性肝损伤（DILI）研究，本研究选用1-氨基苯并三唑（ABT）作为CYP酶广谱抑制剂，探究CYP酶被抑制后APAP所致肝损伤的变化规律。为阐明CYP酶对APAP肝毒性的调控作用，本研究在三维肝球状体体系设置4组实验：空白对照组、4mMAPAP单独给药组、仅ABT预处理1h组、ABT预处理1h后给予4mMAPAP组。4mMAPAP单独处理组细胞活力降至约67.6%；而ABT预处理可显著缓解该损伤，细胞平均活力回升至86.2%。ABT处理后CYP3A4活性平均降至对照水平的12.5%，表明ABT对CYP3A4产生了强烈但未充分的抑制。与对照组相比，APAP处理组线粒体膜电位下降；ABT干预可部分逆转该损伤趋势。氧化应激检测中CellROX荧光结果显示，ABT干预后荧光信号减弱，说明ABT可抑制活性氧（ROS）生成。凋亡标志物活化半胱天冬酶-3仅在APAP单独组出现明显阳性信号，提示细胞凋亡激活；ABT预处理可部分阻断该凋亡通路。

上述结果表明，ABT可短时抑制CYP3A4活性，并在48h内缓解APAP诱发的肝细胞损伤。在肠-肝共培养芯片体系中，先采用ABT预处理1h，再向体系给予APAP（图6A）。监测肝腔APAP浓度后发现，ABT干预组与未干预组的肝腔APAP暴露未见统计学显著差异（图6B）。尽管ABT处理后AST倍数变化无统计学差异（图6C），但ALT升高幅度、白蛋白分泌下降程度均得到轻微改善（图6D、E）。荧光染色结果直观证明ABT预处理可减轻肝损伤（图6F）。相较于APAP静脉给药组，ABT+APAP静脉联用组的PI、CellROX、H2AFX荧光信号轻度降低，线粒体膜电位指标TMRE、凋亡指标活化半胱天冬酶-3损伤信号均有所恢复；CellROX、TMRE及活化caspase-3相关指标的变化幅度均低于未加ABT组（图6G–I）。综上，ABT预处理后肝腔APAP暴露未见显著变化，但氧化应激、线粒体损伤及细胞死亡相关指标有所减轻，支持ABT通过抑制CYP介导的APAP生物活化而缓解肝损伤。由于本研究未直接测定NAPQI，该机制主要由ROS等指标间接支持。

图6为1-氨基苯并三唑（ABT）预处理肠-肝芯片后对乙酰氨基酚（APAP）所致毒性检测结果，其中（A）为实验时序安排；（B）为ABT干预后体系内APAP药物浓度变化；（C、D、E）分别为ABT干预组天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、白蛋白（ALB）相对对照组的变化倍数；（F）为ABT干预后各组APAP相关毒性荧光染色图像（比例尺=100 μm）；（G~I）依次为氧化应激探针CellROX、线粒体膜电位探针TMRE、活化半胱天冬酶-3荧光信号定量面积统计；所有数据均以平均值±标准差表示，样本量n=3；显著性标记及其阈值应根据原始统计结果核实后填写。

5.2 环孢素对大黄素、小檗碱吸收与毒性的影响

为从药物吸收、分布、代谢、排泄（ADME）角度研究转运体介导的药物相互作用，选取中药肝毒性成分大黄素作为受试药物，以环孢素（PGP、MRP2转运体抑制剂）干预大黄素的跨膜转运与毒性效应。

已有文献报道25μM大黄素可对HepG2肝细胞产生毒性，但对Caco-2肠道细胞毒性微弱，符合本肠-肝芯片肝毒性模型的筛选要求。先测定大黄素与环孢素的安全毒性区间，分别在Caco-2单层细胞、肝球状体中完成毒性梯度实验；预实验选取30 μM用于大黄素毒性评价；正式芯片实验中，口服给药模拟组肠腔给予63.3 μM大黄素，静脉给药模拟组双侧给予30 μM大黄素，环孢素干预浓度为1 μM。给药48h后TEER检测结果显示，大黄素、环孢素均会轻微损伤肠道屏障功能（图7B）。与空白组相比，大黄素口服组、大黄素静脉组白蛋白分泌分别下降22.57%、42.13%，提示两组均出现肝损伤（图7C）；单独环孢素无明显肝毒性（图7D），但联用环孢素可轻微加重大黄素肝损伤（图7D）。随后检测芯片内大黄素及其代谢产物，分析药物暴露特征。图7A、E证实大黄素在肠道屏障中发生强烈首过效应，快速经Ⅱ相代谢生成大黄素-O-葡萄糖醛酸苷、大黄素-O-硫酸酯。研究首先确认了大黄素、大黄素-O-葡萄糖醛酸苷和大黄素-O-硫酸酯的UPLC-MS检测信号，随后监测给药后48 h内肝腔的浓度—时间变化（图7F）及肠腔中的浓度或质谱信号强度（图7H）。大黄素联合环孢素口服组的初始实测浓度分别为87.04 μM和86.09 μM；该数值与方法部分63.3 μM的名义给药浓度存在差异，建议向作者核实后说明其计算或测定口径；给药48h后，两组肝腔大黄素终浓度分别为8.45±1.00μM、14.03±1.99μM，组间差异显著（P＜0.05）（图7Fa）；同时大黄素表观渗透系数Papp显著升高（P＜0.05）（图7Ia）。

以上结果说明环孢素干预可显著促进肠道对大黄素的吸收。相较于单纯大黄素口服组，联用环孢素后肝腔内UGT酶代谢产物大黄素-O-葡萄糖醛酸苷的浓度（图7Fb）与占比（图7Jb）显著上升；肠道腔内大黄素-O-葡萄糖醛酸苷水平轻度下降（图7Hb）。环孢素干预后，肠道体系中大黄素清除总量（图7Ib）、大黄素-O-葡萄糖醛酸苷总生成量（图7Ja）均降低。环孢素可能通过抑制PGP/MRP2介导的外排，并影响UGT介导的葡萄糖醛酸化，改变大黄素的肠道吸收、代谢物分布及肝腔暴露；环孢素干预可改变大黄素的肠道吸收、代谢和肝腔暴露。上述结果表明，大黄素可作为该肠-肝芯片的受试化合物，用于观察其毒性、跨膜吸收、转运及肠道首过代谢相关变化。本研究随后选取口服吸收较差、肝毒性较弱的PGP底物小檗碱，作为非毒性剂量下的比较化合物。环孢素为PGP抑制剂，且无明显肝毒性，理论上可提升小檗碱肠道吸收。小檗碱口服组、小檗碱+环孢素口服组初始给药浓度分别为17.77μM、16.48μM；该浓度下小檗碱对Caco-2、肝球状体毒性微弱。肠-肝芯片实验证实小檗碱肝毒性、肠道毒性均较轻。完成样品中小檗碱定量检测，结果显示：相较于单纯小檗碱口服组，联用环孢素后肝腔小檗碱浓度呈上升趋势，肠道腔药物浓度显著降低（P＜0.05）。该结果进一步支持肠道外排转运体可限制药物跨屏障吸收并参与肠道首过处置；环孢素抑制相关转运后，可提高药物进入肝腔的暴露水平。综上，该肠-肝共培养体系可用于研究转运体介导的药物相互作用、继发毒性反应及药物体内暴露水平变化。

图7为环孢素对毒性剂量大黄素口服模拟给药后芯片内处置过程的影响，其中（A）为大黄素在肠-肝芯片内的吸收与主要代谢过程示意图；（B）为肠道屏障跨上皮电阻（TEER）变化曲线；（C、D）为肝腔白蛋白（ALB）含量检测结果；（E）为大黄素Ⅱ相代谢过程示意图；（F）为肠-肝芯片基底侧大黄素（a）、大黄素-O-葡萄糖醛酸苷（b）、大黄素-O-硫酸酯（c）的含量检测结果；（G）为环孢素干预后大黄素转运与代谢变化机制示意图；（H）为给药48 h后肠-肝芯片顶侧大黄素（a）、大黄素-O-葡萄糖醛酸苷（b）、大黄素-O-硫酸酯（c）的检测结果；（I）为肠-肝芯片中大黄素相对表观渗透系数（a）与药物清除量（b）检测结果；（J）为肠-肝芯片体系大黄素-O-葡萄糖醛酸苷总生成量（a）及肝腔中该代谢产物占比（b）；本实验样本量n=3，所有数据均以平均值±标准差（mean ± SD）表示，*P＜0.05。

03 讨论

本研究构建可稳定共培养IBAC®️M1无泵肠-肝器官芯片，采用Caco-2/HT29-MTX-E12构建极化肠道屏障，联合四细胞三维肝球状体开展体外毒理评价，芯片提供的低水平、生理相关流体剪切力可能有助于维持或改善部分肝脏代谢酶和转运体的表达。以对乙酰氨基酚（APAP）为模型药物，证实肠道屏障在调控药物暴露水平、相应毒性反应及首过效应中起到关键作用，时序检测明确肝损伤伴随线粒体功能障碍、氧化应激与凋亡激活。

ABT实验支持CYP介导的生物活化参与APAP肝毒性；环孢素干预大黄素和小檗碱后，模型观察到外排转运受抑及肠道代谢变化所引起的药物暴露改变。现有多数器官芯片仅检测药物通透性，本体系可一体化分析药物暴露-毒性关联、动态追踪时效量效损伤、模拟两类药物相互作用。本模型仍存在肠道吸收和肝脏代谢速率与人体不一致、未使用原代肝细胞、各细胞类型长期命运尚未系统评估，以及紧密连接和转运体定位缺乏充分定量分析等局限；后续需优化芯片结构和流体参数，并补充细胞类型特异性及蛋白表达的定量表征；该芯片可在体外部分重现首过效应以及酶、转运体相关药物相互作用的关键特征，为药物性肝损伤的临床前机制研究和风险评估提供补充性体外平台。