新方法｜卵巢癌HGSC类器官3D共培养模型：14天维持，兼容scRNA-seq

（1）更接近肿瘤生态：将患者来源卵巢癌类器官与CAF、间皮细胞、I型胶原和Cultrex基质组合，重建HGSC相关三维微环境；脂肪细胞凝胶可作为可选模块加入，用于更好模拟大网膜脂肪环境。

（2）样本来源更灵活：除新鲜肿瘤组织外，也可利用冷冻肿瘤组织消化物和腹水来源富集细胞悬液建立CAF或间皮细胞培养，提高珍贵临床样本利用率；脂肪细胞则需从新鲜肿瘤组织中分离并短期培养。

（3）微环境重建：模型含15%基质细胞（12.5%CAF+ 2.5%间皮细胞），脂肪细胞凝胶可作为可选模块加入，以模拟大网膜转移灶的脂肪环境。

（4）多维读出：支持免疫荧光成像、mCherry标记类器官追踪、高内涵成像药敏测试及scRNA-seq分析，可同时观察癌细胞和基质细胞反应。

（5）转化潜力：384孔板微型化方案支持12天药敏流程；4个患者来源模型在scRNA-seq前处理后细胞活率达72%–95%。

02 研究内容

1.为什么只做类器官还不够？

卵巢癌药物反应不是肿瘤细胞单独决定的。肿瘤周围的 CAF、间皮细胞、脂肪细胞和细胞外基质会影响细胞黏附、生长因子信号、营养状态、药物扩散和应激反应。单纯依赖二维细胞系或只含肿瘤上皮成分的类器官，难以充分反映真实肿瘤中的耐药生态。

这篇文章的切入点很明确：要研究HGSC的治疗抵抗，就不能把肿瘤细胞从微环境中"剥离"出来。研究团队真正要解决的是，如何把类器官组织成一个可分析、可干预、可扩展的肿瘤微环境模型。

图2 MC模型组成逻辑：患者来源类器官与CAF、间皮细胞及ECM组分共同构成基础MC模型；脂肪细胞凝胶可作为可选模块加入，以模拟大网膜转移相关的脂肪环境。

2.第一步：建立患者来源基质细胞

MC模型的基础不是“把细胞混在一起"，而是先获得稳定且身份明确的基质细胞。文章分别给出了CAF、间皮细胞和脂肪细胞的获取与培养方案，并重点提供了CAF和间皮细胞的身份验证方法。对于新鲜实体瘤样本，研究团队处理来自大网膜或腹膜、肉眼可见肿瘤的组织：建立CAF时选择无坏死、无血管、无脂肪的区域；分离脂肪细胞时则选择含脂肪、但避开坏死和血管的区域。无脂肪区域可切成约2mm×2mm组织块，用于建立CAF培养；含脂肪区域可切成约5mm×5mm组织块，经胶原酶/透明质酸酶消化后收集脂肪层，用于建立脂肪细胞培养。

图3 新鲜肿瘤样本处理：无脂肪肿瘤区域主要用于建立CAF培养，含脂肪区域则用于分离脂肪细胞，从源头上区分不同微环境组分。

对于冷冻保存样本，文章提供了另一条路线：冷冻肿瘤组织消化物可建立CAF，冷冻腹水来源富集细胞悬液更适合建立间皮细胞。这一点至关重要——临床样本往往稀缺、分批获得且难以即时处理，从冷冻材料中恢复并扩增CAF或间皮细胞，意味着模型建设可以更灵活地对接样本库和后续实验。

细胞身份验证是关键节点。CAF通常呈梭形形态，表达PDGFRβ，部分表达FAP，不表达HGSC标志物PAX8；间皮细胞呈铺路石样形态，表达calretinin（CALB2）。只有身份经验证的基质细胞，才建议进入后续扩增、冻存和模型组装。

图4 CAF培养与鉴定：患者来源CAF呈梭形形态，并通过PDGFRβ、FAP、PAX8等标志物确认其基质细胞身份和非肿瘤上皮属性。

图5 间皮细胞培养与鉴定：间皮细胞表现为铺路石样形态，并可通过CALB2/calretinin和细胞骨架染色进行验证。

3.第二步：用类器官、CAF、间皮细胞和细胞外基质重建MC模型

当患者来源类器官恢复增殖、CAF和间皮细胞处于活跃生长状态后，研究者将它们共同包埋到Cultrex与I型胶原组成的基质中，形成三维dome结构。

标准方案中，MC模型含15%基质细胞（12.5%CAF+ 2.5%间皮细胞）。脂肪细胞凝胶还可连接到MC dome 上，作为模拟大网膜脂肪微环境的可选模块。

图6 脂肪细胞模块加入策略：脂肪细胞凝胶可通过小体积胶原液滴固定在MC dome上方或多个dome之间，用于模拟大网膜转移相关脂肪环境。

整个组装过程约2小时：细胞计数后与Cultrex/I 型胶原混合基质重悬，每孔接种10个20μL dome，37℃孵育成胶，再加入含Y-27632的培养基帮助细胞恢复。模型通常可培养10–14天。

这一步的意义在于，类器官不再只是“孤立的三维肿瘤团块"，而被放入一个由癌细胞、基质细胞和ECM共同参与的可控微环境中。

4.第三步：用mCherry和免疫荧光把癌细胞与基质细胞区分开

多细胞模型的难点在于：细胞混在一起后，如何判断药物杀伤的是癌细胞还是基质细胞？文章提供了两类读出策略。

第一类是mCherry标记患者来源类器官，使癌细胞在成像中呈红色信号；第二类是免疫荧光染色，以PAX8标记 HGSC癌细胞，Ki67评估增殖，F-actin展示细胞骨架。通过这些标记，研究者可以观察不同细胞在三维基质中的空间分布、增殖状态和药物反应。

图7 MC模型成像读出：免疫荧光中的PAX8、Ki67、F-actin，以及可选的mCherry标记类器官策略，可帮助识别癌细胞、评估增殖状态，并观察模型内部空间结构。

这让MC模型不只是“看起来更复杂"，而是能够进入定量分析。对药筛而言，区分癌细胞死亡和基质细胞死亡尤其重要，因为两者对应的转化意义和风险判断较为不同。

5.第四步：把MC模型微型化到384孔板，进入高通量药物敏感性测试

为了服务药物筛选，文章进一步建立了384孔板微型化方案。研究者将细胞-基质混合物以10 μL/孔接种到预冷384孔板中，成胶后加入40 μL培养基；第7天加入药物处理，例如48小时后换液，第12天进行终点检测。

图8 384孔药敏测试示例：MC模型可被微型化到384孔板，并结合高内涵成像区分癌细胞死亡和基质细胞死亡。

终点读出包括CellTox Green细胞毒性检测和CellTiter-Glo 2.0细胞活力检测。若使用mCherry标记类器官，还可结合红色荧光与死亡信号，分别计算癌细胞死亡和基质细胞死亡。

这套方案的亮点在于把复杂三维多细胞模型接入自动化药筛系统：液体处理、声学加药和高内涵成像可以协同完成，使MC模型不再停留于低通量展示，而是具备平台化筛选潜力。

6.第五步：将模型处理为适合单细胞RNA测序的细胞悬液

文章还给出了MC模型进入scRNA-seq的处理流程。若模型中含有脂肪细胞凝胶，研究者需先将其去除，再用I型胶原酶和TrypLE分步消化MC dome，经过滤、低速离心和质量检查后获得用于单细胞建库的细胞悬液。

图9 scRNA-seq样本制备流程：MC dome需经胶原酶和TrypLE分步消化，获得适合单细胞建库的细胞悬液。

需要注意的是，脂肪细胞浮力高、细胞脆弱且体积大，与常规液滴式单细胞平台不兼容，因此在scRNA-seq处理前需去除。这个细节也提示：模型可以更接近真实肿瘤，但不同下游技术仍有各自边界。

在作者实验条件下，4个患者来源模型在未处理或接受卡铂（10 μM）与紫杉醇（15 nM）8小时处理后，经该流程处理进入scRNA-seq前，细胞活率为72%–95%。这说明MC模型不仅能提供药物反应读出，也能进一步解析不同细胞群在药物刺激后的转录状态。

7.这套模型的边界在哪里？

该文是一篇protocol，核心价值在于提供可复现的 HGSC三维多细胞建模流程，而非验证某种药物的新疗效。因此，体外药物敏感性结果仍需结合进一步临床验证，不能单独作为临床用药依据。该模型也有明确边界：患者来源类器官和基质细胞的建立具有经验性，成功率难以充分预测；实际操作中，也不一定能从同一患者或同一样本类型获得全部所需细胞，必要时可使用非配对基质细胞。此外，尽管模型可纳入CAF、间皮细胞、ECM，并可选择性加入脂肪细胞凝胶，但仍不能等同于完整人体肿瘤。免疫细胞、血管化、流体剪切力、药代动力学和长期治疗压力等因素尚未充分整合。因此，它更适合作为卵巢癌微环境与药物反应研究的平台，而不是临床验证的替代品。