更新时间：2026-05-13
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肠道黏膜免疫的正常建立与稳态维持是抵御炎症性肠病、肠道肿瘤等疾病的关键，生命早期断奶期是肠道菌群重塑与免疫发育的关键窗口期，此阶段菌群紊乱会显著增加成年后肠道炎症与肿瘤易感性。此前研究已知断奶反应与菌群参与免疫调控，但断奶期菌群如何通过表观遗传机制在肠道干细胞中形成持久免疫记忆、进而影响终身黏膜免疫的具体机制仍不明确。
贝勒医学院与同济大学团队联合在Nature Microbiology发表研究，阐明了断奶期肠道菌群通过表观遗传调控肠道干细胞、塑造终身黏膜免疫记忆的核心机制，有效补齐了早期菌群暴露与长期免疫调控之间的机制空白。该研究以类器官为关键体外模型，直接验证了关键信号对肠道干细胞表观遗传重编程与转录记忆的诱导作用。
01 研究亮点
1.关键窗口期机制：初次明确断奶期是肠道菌群介导表观遗传重编程的关键时间窗，菌群通过调控肠道干细胞DNA甲基化，形成可稳定遗传至成年的免疫记忆。
2.核心调控通路：发现革兰氏阳性菌—IFNγ—表观修饰轴是驱动肠道上皮MHC-II表达、建立黏膜免疫的核心通路，早期抗生素干扰该通路会直接增加肠炎与肠道肿瘤易感性。
3.类器官模型精准验证：借助肠道类器官模型直接复现干细胞表观遗传重编程与免疫记忆效应，在体外证实IFNγ可诱导增强型转录记忆。
02 研究内容
1.肠道微生物组调控肠道干细胞的位点特异性表观遗传重塑
研究者通过构建无菌小鼠(GF)与无病原体小鼠（SPF）的Lgr5-GFP小鼠模型，发现15周GF小鼠结肠存在形态异常：隐窝变短、增殖细胞减少、杯状细胞分布异常，但两组Lgr5+肠道干细胞数量无显著差异。菌群不影响全局甲基化，但在肠道干细胞中筛选出1463个差异甲基化区域（DMR）与821个关联基因。干细胞与分化上皮细胞共有683个DMR，可随分化稳定遗传；其中51%位于增强子区域（Fig1a-c）。
SPF小鼠中共有DMR以低甲基化为主，低甲基化基因富集免疫与宿主防御通路，高甲基化基因富集发育相关通路。SPF小鼠MHC-II、天然免疫与宿主防御基因的启动子近端增强子区域显著低甲基化，且该修饰可稳定传递至分化细胞（Fig.1d-f）。SPF 组肠道干细胞与分化上皮中 MHC-II 及防御基因表达显著升高，与 DNA 甲基化水平呈负相关（Fig. 1g）。
图1 增强子持续性低甲基化是菌群驱动黏膜免疫调控的核心基础。a. 无菌（GF）Lgr5-GFP小鼠重新培育的实验示意图。15周龄时，无菌条件下小鼠的结肠隐窝更短；b. 流式细胞术结果显示，15周龄无特定病原体（SPF）小鼠与无菌小鼠结肠中Lgr5+肠道干细胞（ISC）比例相近；c. 全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）鉴定出的差异甲基化区域（DMR）数量。在肠道干细胞（ISC）与肠上皮细胞（IEC）中持续受菌群调控的共有DMR，大多分布在增强子区域；d. 绝大多数共有DMR在SPF小鼠中呈现低甲基化状态；e. 对共有DMR关联基因的GO分析显示，甲基化上升与下降的基因分别富集于不同生物学过程；f. 结合ENCODE注释的基因组浏览器图谱显示，MHC-II基因及宿主防御基因在启动子近端增强子（enhP）区域存在DMR，且在SPF小鼠的ISC与IEC中均表现为持续性低甲基化；g. RNA测序（RNA-seq）检测到这些低甲基化基因在ISC及其分化子代IEC中均发生转录激活。
2.断奶后是菌群驱动表观遗传重编程的关键窗口期
断奶期（3周）SPF与GF小鼠的ISC和IEC均呈高甲基化，无显著差异；成年SPF小鼠两类细胞出现显著低甲基化，GF小鼠无变化。对SPF小鼠不同年龄段检测发现，MHC-II在4-6周快速去甲基化，宿主防御基因去甲基化更晚更慢；甲基化变化早于或同步于转录变化（Fig.2a-c）。
研究者设计了不同年龄肠道菌群移植（GMT）实验，宏基因组测序显示各组移植后门水平定植效率相当。断奶后3-4周进行GMT，能较有效恢复ISC中MHC‑II的表观调控；青春期或成年移植效果递减，且无法充分恢复，证实断奶后是关键窗口期（Fig.2d-f）。
图2 断奶后肠道菌群驱动肠道干细胞的甲基化动态变化与基因调控。小鼠出生后发育阶段的时间轴；b. 菌群介导的持续性低甲基化在断奶后于成年小鼠的肠道干细胞（ISC）和肠上皮细胞（IEC）中出现；c. 对比断奶前（2周龄，n=4）与断奶后（4-20周龄，各年龄组n=2-3）的甲基化与基因表达变化；d. 在不同年龄组开展肠道菌群移植（GMT）实验的示意图；e. 宏基因组全基因组测序显示，各菌群移植后组在门水平的菌群组成相似；f. 对断奶后无菌小鼠进行肠道菌群移植可恢复肠道干细胞的表观遗传调控。
3.革兰氏阳性菌介导表观遗传重编程
研究者提出假说：断奶期菌群诱导的短暂IFNγ峰介导MHC-II调控区域的位点特异性去甲基化，他们发现仅在断奶后阻断IFNγ，会全面消除上皮MHC-II表达、破坏低甲基化与转录激活，而成年阻断IFNγ无此效果（Fig.3a-c）。
图3 断奶后IFNγ信号是菌群诱导肠上皮MHC-II表观遗传调控的必需条件。断奶后小鼠实验设计。刚断奶的小鼠（3周龄）在2周内接受对照IgG或IFNγ中和抗体处理共4次，3周后进行检测分析。结肠肠上皮细胞（IEC）的MHC-II表达流式结果显示，阻断IFNγ会消除上皮MHC-II的表达; b. 对15周龄成年小鼠采用相同的处理方案、给药频率与检测时间线。与断奶后组不同，成年小鼠中和IFNγ并未显著改变上皮MHC-II表达;c. 分别检测断奶后组（蓝色高亮）与成年组（黄色高亮）在使用/不使用抗IFNγ抗体处理时，MHC-II基因的DNA甲基化水平与基因表达量。仅在断奶后短期内阻断IFNγ，会破坏菌群诱导的MHC-II基因低甲基化与转录激活；在成年期阻断则无此作用。
4.革兰氏阳性菌介导表观遗传重编程
革兰氏阳性菌是强效IFNγ诱导物，因此研究者探究了其在生命早期对肠上皮MHC-II表观遗传编程的作用。用低剂量青霉素（LDP）持续处理孕鼠及其子代，以减少食粪小鼠体内微生物（Fig. 4a）。小鼠肠道菌群在2-4周龄快速扩张，断奶后4-12周趋于稳定（Fig. 4b）。LDP特异性降低革兰氏阳性菌，不影响整体菌群丰富度与扩张能力；厚壁菌门、放线菌门丰度下降，拟杆菌门等革兰氏阴性菌相对增加（Fig. 4b， c）。革兰氏阳性菌减少，导致肠道上皮内淋巴细胞（IEL）中CD4+IFNγ+ T细胞数量相应下降（Fig. 4d）。LDP使结肠上皮MHC-II基因甲基化升高、表达降低；流式证实EpCAM+肠上皮细胞表面MHC-II蛋白表达下降（Fig. 4e， f）。早期LDP暴露使DSS诱导的结肠炎发病更快、症状更重，表现为体重快速下降、疾病活动指数升高、上皮持续损伤，对照组可明显恢复（Fig. 4g-i）。生命早期菌群-IFNγ轴通过表观遗传调控肠上皮MHC-II，为断奶后肠道干细胞（ISC）提供抵抗肠道炎症与肿瘤发生的保护作用。
图4 生命早期暴露于低剂量青霉素破坏断奶后MHC-II信号通路的表观遗传调控。a. LDP处理及后续分析的实验设计; b. 对照组小鼠与LDP处理组小鼠在断奶前（2周龄）及断奶后（4-12周龄）粪便样本的物种丰富度稀释曲线。每条线代表一个粪便全基因组测序（WGS）样本，颜色代表年龄组;c. 对照组与LDP处理组小鼠在断奶前及断奶后的微生物门水平相对丰度; d. LDP处理使8周龄小鼠中产生IFNγ的CD4+ T细胞减少; e. LDP处理改变了8周龄SPF小鼠肠上皮细胞（IEC）在断奶后正常发生的MHC-II基因表观重编程; f. LDP处理降低了8周龄小鼠上皮细胞MHC-II的表达; g. 反复使用DSS进行诱导的实验设计; h， i. LDP预处理组与对照组小鼠在反复DSS诱导周期中的体重变化率（h）与疾病活动指数（DAI）（i）。
5.菌群源性代谢物参与断奶驱动的表观遗传重编程
低剂量青霉素（LDP）会减少多种与断奶过程相关的细菌属，包括芽孢杆菌属、粪杆菌属、布劳特氏菌属、罗斯氏菌属、别样杆菌属、图里西单胞菌属/图里西杆菌属以及粪球菌属（fig5a）。在菌种水平上，LDP会阻止链状芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、肠道罗斯氏菌、哈氏别样杆菌的增殖，而这些细菌在断奶后、固体食物中膳食纤维引入的情况下通常会大量增殖（fig5b）。LDP还会降低鼠李糖乳杆菌和生孢梭菌的丰度，这两类菌可促进微生物利用氨基酸合成α-酮戊二酸（α-KG），而α-KG是宿主DNA去甲基化酶发挥去甲基化作用的关键辅因子（fig5c）。GO分析显示，表观遗传调控通路发生显著改变（fig5d），包括影响α-KG生成的异柠檬酸脱氢酶活性、Fe²+跨膜转运蛋白活性，以及抑制DNA甲基转移酶（DNMT）的甲硫氨酸γ-裂解酶活性（图5e）。
综上，断奶过程所诱导的、可产生短链脂肪酸与α-酮戊二酸的微生物，共同参与了IFNγ介导的肠道干细胞MHC-II表观遗传重编程；而断奶后使用LDP处理，会严重破坏这一肠道生理过程。
图5 生命早期低剂量青霉素处理改变肠道菌群组成，并破坏代谢物介导的表观遗传重编程。a. 水平宏基因组全基因组测序显示，正常情况下在断奶后定植于肠道的特定细菌类群，因生命早期LDP暴露而被耗竭; b. LDP处理使4种通常在断奶后增殖的产短链脂肪酸（SCFA）细菌耗竭; c. LDP处理后，两种可产生α-酮戊二酸（α-KG）、乳酸、吲哚-3-丙酸（IPA）等能直接或间接调控表观遗传的代谢物的细菌丰度下降; d. 微生物代谢物促进TET介导的DNA去甲基化与染色质开放的机制; e. GO富集分析显示，与表观遗传相关的酶活性通常在断奶后上升，但会被LDP处理破坏。
6.菌群源性代谢物参与断奶驱动的表观遗传重编程
6.1 IFNγ处理后24小时即可检测到Cd74增强子区域去甲基化，且伴随表达上调（Fig. 6a）。染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR证实，STAT3和TET3特异性富集于去甲基化的Cd74增强子区域（ChIP-2/3），而非甲基化区域或非DMR对照区（ChIP-1）；STAT1、TET1/2无富集现象（Fig. 6b）。TNF、丁酸钠（NaB）、脂多糖（LPS）单独处理均不改变Cd74甲基化状态；仅IFNγ与去甲基化药物地西他滨（DAC）联合处理可增强去甲基化并进一步升高Cd74表达（Fig. 6c）。增强子去甲基化仅增加DNA可及性，转录激活仍依赖IFNγ-STAT信号等诱导信号，DAC单独处理无法激活Cd74表达。菌群诱导的肠道干细胞（ISC）增强子去甲基化，不改变基础基因表达，但使上皮细胞对后续刺激产生更快、更强的应答——即表观遗传形式的训练性记忆。
6.2 类器官模型验证训练性记忆：对无菌（GF）小鼠来源类器官连续3次用IFNγ处理、7天洗脱后，二次刺激IFNγ或TNF：三次IFNγ处理已去除Cd74增强子甲基化，证实干细胞水平去甲基化（Fig. 6d， e）； IFNγ预处理组在二次刺激下，Cd74表达显著升高且峰值提前（36小时），且对TNF非特异性刺激也表现出快速、增强的诱导效应（Fig. 6f）。
6.3 菌群直接调控甲基化依赖的记忆样反应：构建3组15周龄小鼠结肠类器官（GF、SPF、断奶期接受菌群移植（GMT）的GF小鼠）（Fig. 6g），发现SPF组与GMT组的MHC-II相关基因（Cd74、H2-Eb1、H2-Aa、Ciita）均显著去甲基化，且甲基化模式一致，证实菌群的直接调控作用（Fig. 6h）；IFNγ刺激后，SPF组与GMT组MHC-II基因激活更早（6小时）、程度更强，相较于GF组具有显著优势（Fig. 6i）。
因此，断奶驱动的菌群变化是ISC增强子区域MHC-II相关表观遗传重塑的关键调控因子，并对上皮细胞内在免疫及组织应答产生持久影响。
图6 IFNγ刺激通过MHC-II基因增强子介导的表观重编程，诱导肠道干细胞产生转录记忆。a. 低浓度IFNγ（0.1 ng/ml）处理无菌小鼠结肠类器官，对Cd74甲基化与表达进行时序分析，结果显示IFNγ可快速诱导去甲基化并伴随基因激活; b. DNA去甲基化酶TET3介导IFNγ诱导的Cd74表观重编程。图中展示Cd74基因位点、基因组位置、分选Lgr5-GFP+肠道干细胞的ATAC-seq峰（GSE83394）、菌群诱导的差异甲基化区域（虚线框），以及用于ChIP-qPCR检测STAT与TET蛋白结合的引物位置。与非DMR对照区域（ChIP-1）相比，STAT3和TET3在IFNγ处理后于DMR/增强子区域（ChIP-2、ChIP-3）的结合显著增加; c. IFNγ与去甲基化药物地西他滨（DAC）联合处理，可协同增强IFNγ诱导的去甲基化与转录激活；相反，单独使用TNF、丁酸钠（NaB）或LPS均不会改变Cd74的甲基化状态; d. 检测类器官转录记忆：设置IFNγ预处理组（primed）与未预处理组（naïve），预处理后的类器官在无IFNγ条件下静置7天，再用IFNγ或TNF二次刺激，记忆效应表现为Cd74表达更快、更强的诱导; e. 二次刺激前，连续3代接受IFNγ处理的类器官（预处理组）中，Cd74几乎去甲基化; f. 与未预处理类器官相比，IFNγ预处理类器官在IFNγ（左）或TNF（右）二次刺激下，Cd74表达更快、更强; g. 验证菌群是否驱动上皮MHC-II甲基化依赖型转录记忆的实验设计; h. 对15周龄成年无菌（GF）、无特定病原体（SPF）及断奶期进行菌群移植（GF→SPF）小鼠来源的类器官，在第2代后检测MHC-II基因甲基化水平; i. 通过RT-qPCR检测发现，IFNγ刺激可在SPF与GF→SPF类器官中诱导甲基化依赖型、记忆式的MHC-II基因（Cd74、H2-Eb1、H2-Aa、Ciita）转录激活。
03 研究前景
1.理论创新前景：揭示了生命早期菌群介导的表观遗传调控新层次，不改变全局甲基化，仅特异性作用于增强子区域，突破传统以启动子为中心的甲基化调控范式。
2.机制研究前景：明确断奶期是菌群调控肠道干细胞表观编程的关键时间窗口，为后续探索肠道发育、免疫驯化的时序调控提供明确研究靶点，为菌群、代谢物、表观修饰等交互作用研究提供可延伸的实验范式。
3.临床转化前景：上皮MHC-II表观调控状态可作为IBD、早发性结直肠癌的潜在生物标志物，实现高危人群早期筛查。
4.未来研究方向：进一步鉴定驱动表观重编程的关键功能菌株与代谢物，实现精准菌群干预。探索人类断奶期是否存在保守的表观调控关键窗口，完成小鼠到人类的转化验证。研究表观记忆的跨代传递可能性，拓展生命早期编程对长期健康的影响边界。
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